Ngôn ngữ :    
Loading
2011 - ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH CÁC LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THƯỜNG GẶP
Thứ 5, 10-03-2011

Nguyễn Thị Tân Sinh1 , Ngô Diễm Ngọc2, An Thuỳ Lan2, Đinh Thị Hồng Nhung2, Lê Thị Liễu2, Nguyễn Thanh Liêm2
1Khoa Sản - Bệnh Viện Bạch Mai
2Khoa Di truyền và Sinh học phân tử - Bệnh Viện Nhi Trung Ương

Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và sinh học phân tử, trong đó đầu dò đặc hiệu được lai với nhiễm sắc thể (NST) ở kỳ giữa, và/hoặc nhân tế bào ở gian kỳ, nhằm phát hiện một cách chính xác các bất thường NST. Mục tiêu: 1) Nghiên cứu xây dưng quy trình chẩn đoán trước sinh bằng kỹ thuật FISH. 2) Phát hiện các lệch bội NST 13,18,21,X,Y từ tế bào dịch ối bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: chọc ối và bảo quản mẫu theo quy trình thống nhất, tiến hành kỹ thuật FISH và nuôi cấy NST theo phương pháp mới cho 22 thai phụ mang thai 17-25 tuần có nguy cơ cao bị dị tật. Kết quả: phát hiện 01 hội chứng Patau (trisomy 13), 01 hội chứng Down (trisomy 21), 01 bất thường nhánh dài NST 16. 100% mẫu kết quả FISH phù hợp với kết quả phân tích NST về NST 13,18,21,X,Y. Không có tai biến do chọc ối. Kết luận: Xây dựng được quy trình chẩn đoán trước sinh bằng chọc ối làm xét nghiệm FISH  an toàn. FISH là  phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác các lệch bội NST cho những thai phụ có nguy cơ cao.

Từ khoá: Nhiễm sắc thể, FISH, chẩn đoán trước sinh, amniocentesis.

Bài báo tham dự Hội nghị Khoa học Bệnh viện Bạch Mai lần thứ 28 - 2011
(Tạp chí Y học lâm sàng, số đặc biệt, tháng 2 - 2011, trang 253-258)

I. ĐẶT VẤN ĐỀ:

          Chẩn đoán trước sinh cho những thai phụ có nguy cơ cao và những gia đình có tiền sử bệnh di truyền đang trở thành vấn đề cấp thiết nhằm nâng cao chất lượng xã hội, giảm gánh nặng của gia đình. Cùng với sự tiến bộ của siêu âm hình thể chẩn đoán dị tật thai, các kỹ thuật hiện đại về sinh hóa, miễn dich, di truyền, sinh học phân tử ngày càng phát triển, mở ra những khả năng mới cho công tác chẩn đoán trước sinh (2,3,7,8). Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH: Fluorescence insitu hybridization), là kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và sinh học phân tử, trong đó đầu dò đặc hiệu được lai với nhiễm sắc thể (NST) ở kỳ giữa, và/hoặc nhân tế bào ở gian kỳ, nhằm phát hiện một cách chính xác các bất thường NST (6) . Một trong những ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh là nhằm phát hiện các lệch bội NST thường gặp như 13,18,21, X,Y (10). Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu:

          1.   Nghiên cứu xây dưng quy trình chẩn đoán trước sinh bằng kỹ thuật FISH
          2.   Phát hiện các lệch bội NST 13,18,21,X,Y từ tế bào dịch ối bằng kỹ thuật FISH.


II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu:

          Từ tháng 5/2009 đến tháng 01/2011, Khoa Phụ Sản Bệnh viện Bạch Mai kết hợp với Khoa Di truyền và Sinh Học phân tử Bệnh viện Nhi TW tiến hành chọc ối làm chẩn đoán trước sinh cho 28 thai phụ có nguy cơ cao, áp dụng kỹ thuật FISH và đối chiếu với kết quả nuôi cấy NST từ tế bào ối để đánh giá tình trạng lệch bội NST 13,18,21,X,Y.

2. Phương pháp nghiên cứu:

          Các thai phụ có kết quả siêu âm bất thường hoặc xét nghiệm bộ ba (Triple test) thuộc nhóm nguy cơ cao được bác sỹ Sản khoa và bác sỹ chuyên khoa Di truyền tư vấn về phương pháp chọc hút nước ối, kỹ thuật FISH và nuôi cấy tế bào ối, những nguy cơ, giới hạn của các kỹ thuật này.

          2.1.  Quy trình chọc hút nước ối: chọc hút nước ối tại Khoa Sản Bệnh viện Bạch Mai theo quy trình thống nhất, chỉ do một bác sỹ tiến hành dưới hướng dẫn của siêu âm, trong điều kiện vô trùng, với tuổi thai từ 17 tuần trở lên . 

          - Siêu âm kiểm tra thai: các số đo, tim thai, vị trí bánh rau. Chọn vị trí chọc kim thuận lợi (khoang ối rộng, xa các phần thai, đặc biệt đầu thai nhi)

          - Kim chọc ối: dùng kim chọc tủy sống số 22G

          - Dùng bơm tiêm 5 ml hút loại bỏ 2 ml dịch ối đầu tiên để tránh lẫn tế bào của mẹ.

          - Thay bơm tiêm 20ml, hút 15-18ml dịch ối. Dịch ối có màu vàng sáng, không lẫn máu của mẹ

          - Mẫu dịch ối được lấy vào ống Falcon 15ml vô trùng. Bảo quản ở 40C từ 24 - 48h kể từ khi lấy mẫu. Chuyển về Khoa Di truyền- Bệnh viện Nhi TW làm FISH với tế bào ối trực tiếp, song song với nuôi cấy NST từ tế bào ối. Mục đích nuôi cấy NST là để kiểm chứng độ nhạy và đặc hiệu của kỹ thuật FISH, phát hiện các bất thường NST khác không nằm trong nhóm NST mà kỹ thuật FISH sàng lọc.

          2.2.  Kỹ thuật FISH:

          - Xử lý bệnh phẩm: Mẫu được xử lý theo quy trình thống nhất bằng Trypsin-EDTA 1X (Gibco),  dung dịch KCl 0.075M, dung dịch cố định Methanol. 

          - Tạo tiêu bản: Nhỏ cặn tế bào lên lam kính sạch. Đánh giá mật độ tế bào dưới kính hiển vi soi ngược.

          - Nhỏ đầu dò : 10µl đầu dò đặc hiệu cho NST 13,18,21,X,Y (Vysis) trên vùng tế bào đã đánh dấu. Vùng lai với đầu dò được phủ bằng DAPI (Sigma), cuối cùng được phủ bằng lamme 22x22mm (BDH).

          - Phân tích dưới hệ thống kính hiển vi huỳnh quang với phần mềm ISIS (Metasystem). Đếm tối thiểu trên 50 nhân tế bào đối với từng loại đầu dò. Kết luận kết quả lai bình thường nếu trên 80% nhân tế bào có 2 tín hiệu đối với từng loại đầu dò. Kết luận kết quả lai bất thường khi có trên 30% nhân tế bào có số tín hiệu bất thường đối với từng loại đầu dò.

          2.3.  Kỹ thuật nuôi cấy nhiễm sắc thể từ tế bào ối:

          Nuôi cấy NST từ tế bào ối theo phương pháp mới trên lammen 22x22mm. Thực hiện chụp ảnh ít nhất 05 cụm NST bằng hệ thống Karyotyping (Karl Zeiss) và phân tích bằng phần mềm IKaros (Metasystem). Đếm 20 cụm dưới kính hiển vi thường.

          2.4.  Theo dõi sau thủ thuật, trả kết quả và tư vấn:

          Các thai phụ tiếp tục được theo dõi quá trình thai nghén. Khi có kết quả, bác sỹ Sản khoa và Di truyền sẽ hội chẩn thống nhất chẩn đoán để trả lời và tư vấn cho thai phụ và gia đình.


III. KẾT QUẢ:

          3.1.  Có 28 thai phụ được tiến hành chọc ối làm xét nghiệm chẩn đoán trước sinh

          Tuổi mẹ từ 25-35: 19 người. Tuổi > 35: 9 người

          Tuần thai từ 17-20: 26. Từ 21-25:2

          3.2.  Kỹ thuật FISH và kết quả phân tích NST từ tế bào ối:            

           http://ditruyen.com/upload/2011-03-08/2011-03-08-02-55-34-3.png


            http://ditruyen.com/upload/2011-03-08/2011-03-08-02-55-54-3.png

            http://ditruyen.com/upload/2011-03-08/2011-03-08-02-56-11-3.png

          3.3.  Đối chiếu kết quả FISH và kết quả nuôi cấy NST từ tế bào ối|:

          Kết quả FISH sau 24 - 48 h thấy có 1 trường hợp lệch bội với NST 13 và 1 trường hợp lệch bội với NST 21. 01 trường hợp có bất thường nhánh dài NST 16, không nằm trong nhóm NST mà kỹ thuật FISH sàng lọc. 100% kết quả FISH phù hợp với kết quả phân tích NST từ tế bào ối sau 10 ngày.

          3.4.  Đối chiếu kết quả phân tích NST từ tế bào ối với kết quả sàng lọc ban đầu:

          2 trường hợp lệch bội đều có kết quả siêu âm bất thường. Trường hợp bất thường nhánh ngắn của NST16 không phát hiện bất thường về siêu âm nhưng kết quả Triple test  nằm trong nhóm nguy cơ cao

          3.5.  Theo dõi kết quả và biến chứng do chọc ối:

          28 mẫu nước ối đều đạt yêu cầu làm xét nghiệm FISH và nuôi cấy tế bào làm NST thành công. Không có tai biến gì trong và sau chọc ối.

          03 trường hợp có bất thường về nhiễm sắc thể gia đình xin đình chỉ thai. 14 trường hợp sinh con bình thường. 11 trường hợp chưa sinh thai phát triển bình thường, tuổi thai từ 25-37 tuần , siêu âm kiểm tra không thấy có gì bất thường .   


IV. BÀN LUẬN

          Quy trình chọc ối, bảo quản dịch ối tại khoa Phụ Sản bệnh viện Bạch Mai tốt, không có tai biến gì trong và sau chọc. Y văn thế giới thông báo tỷ lệ tai biến từ 1-2% (10) . Không quan sát thấy tai biến có  lẽ do kỹ thuật được tiến hành ở tuổi thai từ 17 tuần trở lên, chỉ một người thực hiện và nhóm nghiên cứu nhỏ. Các mẫu dịch ối đảm bảo về số lượng và không có mẫu nào nhiễm máu mẹ. Điều này giúp giảm thiểu nguy cơ lẫn tín hiệu của tế bào mẹ trong quá trình lai tín hiệu và nhận định kết quả.

          Trong chẩn đoán trước sinh, kỹ thuật nuôi cấy NST từ tế bào ối cổ điển đã được xem như một ứng dụng hiệu quả và chính xác trong một thời gian dài. Tuy nhiên, với phương pháp cổ điển, thời gian chờ đợi ít nhất là 3 tuần, gây tâm lý lo âu cho sản phụ. Đặc biệt khó khăn nếu phải thực hiện nuôi cấy lại lần 2 do lần 1 chưa đủ để kết luận. Khoa Di truyền và SHPT BV Nhi TƯ đă tiến hành nuôi cấy tế bào ối theo phương pháp mới trên lammen kích thước nhỏ 22x22mm cho phép có kết quả NST sau 10 ngày. Đây là bước tiến lớn trong việc giảm thời gian chờ đợi của thai phụ, trường hợp thai bất thường cần đình chỉ thai nghén sẽ ít khó khăn về kỹ thuật và giảm gánh nặng tâm lý do tuổi thai còn nhỏ.

          Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là một kỹ thuật mới có giá trị sàng lọc cao các lệch bội NST thường gặp. Kỹ thuật FISH được thực hiện trên nhân tế bào ở gian kỳ không qua thời gian nuôi cấy tế bào, có kết quả sau 24 - 48h, mang lại lợi ích đáng kể cho sản phụ và cũng như các nhà sản khoa, đặc biệt trong trường hợp cần đưa ra các quyết định liên quan đến đình chỉ thai nghén. Nhiều nghiên cứu so sánh độ nhạy và độ chính xác giữa hai kỹ thuật FISH và nuôi cấy tế bào, chứng minh khả năng ứng dụng kỹ thuật FISH như một công cụ chẩn đoán nhanh, chính xác trong chẩn đoán trước sinh đối với các trường hợp thai kỳ nguy cơ cao với các lệch bội NST thường gặp như 13,18,21,X,Y (1, 4, 10) .

          Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ phát hiện bất thường NST chung là 10,7%. Tỷ lệ phát hiện lệch bội NST 13,18,21,X,Y là 7,14%, Kết quả này tương đối phù hợp kết quả của tác giả Bùi Võ Minh Hoàng là 9,29% (1). Các trường hợp này đều thực hiện song song kỹ thuật FISH và nuôi cấy NST từ tế bào ối. Chúng tôi đã phát hiện được 1 trường hợp Trisomy NST 13 và 1 trường hợp Trisomy NST 21. 1 trường hợp bất thường NST 16, không phát hiện được trên kỹ thuật FISH, do đây là bất thường không nằm trong nhóm NST mà kỹ thuật FISH sàng lọc. Do đó, dù kỹ thuật FISH là một công cụ chẩn đoán nhanh và chính xác các lệch bội NST thường gặp, vẫn  nên tiến hành song song với nuôi cấy NST từ tế bào ối để loại trừ các bất thường về số lượng và cấu trúc của các NST khác (5, 9) Chúng tôi chưa ghi nhận trường hợp nào có sự không phù hợp giữa hai kỹ thuật này. Tuy nhiên, do số lượng mẫu còn hạn chế trong một khoảng thời gian 20 tháng, nên cần được tiếp tục nghiên cứu với một số mẫu lớn hơn.

          Đối chiếu kết quả xét nghiệm di truyền với kết quả sàng lọc ban đầu bao gồm Triple Test và siêu âm thai nhi, chúng tôi nhận thấy cả 2 trường hợp có lệch bội NST số 13 và 21 đều được phát hiện có hình thái bất thường qua siêu âm, trong đó có 1 trường hợp có kết quả triple test dương tính, trường hợp còn lại không được làm triple test. Đối với trường hợp bất thường cấu trúc NST số 16, kết quả triple test dương tính nhưng không có hình ảnh bất thường trên siêu âm. Do vậy, kết hợp triple test, siêu âm thai và xét nghiệm di truyền có ý nghĩa quan trọng trong sàng lọc và chẩn đoán trước sinh


V. KẾT LUẬN:

          Chúng tôi đã xây dựng được quy trình chẩn đoán trước sinh bằng chọc ối làm xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang an toàn.  Ứng dụng kỹ thuật FISH kèm nuôi cấy NST từ tế bào ối phát hiện  3/28 trường hợp có bất thường NST (10,7%), 2/28 trường hợp có lệch bội NST (7,14%). Trong đó 01 trường hợp Trisomy 13 (hội chứng Patau), 01 trường hợp Trisomy 21 (hội chứng Down), 01 trường hợp bất thường nhánh dài NST 16. Kỹ thuật FISH đã được sử dụng như một công cụ chẩn đoán xác đinh hiệu quả, nhanh, chính xác, đặc biệt cho những thai phụ có nguy cơ cao về lệch bội NST.


TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt
1. Bùi Võ Minh Hoàng, Nguyễn Duy Tài, Phan Chiến Thắng. Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang ( FISH) trong chẩn đoán trước sinh các dị  bội nhiễm sắc thể thường gặp .Báo cáo Hội nghị quốc tế tư vấn di truyền – sàng lọc và chẩn đoán trước sinh. Đại học Y Hà nội ,2007.
2. Nguyễn Thị Tân Sinh. Vai trò của Triple test và thử nghiệm nhiễm sắc thể qua chọc hút nước ối trong chẩn đoán dị tật thai tại Khoa sản Bệnh viện Quốc tế Việt Nam. Công trình Nghiên Cứu Khoa Học Bệnh viện Bạch Mai. 1999-2000. Trang 416-420. Nhà xuất bản Y Học.
3. Trần Danh Cường. Hình ảnh siêu âm ở thai nhi bất thường nhiễm sắc thể. Báo cáo Hội nghị quốc tế tư vấn di truyền – sàng lọc và chẩn đoán trước sinh. Đại học Y Hà nội, 2007.

Tài liệu nước ngoài
4. Feldman B. et al (2000) Routine prenatal diagnosis of aneuploidy by FISH studies in high risk pregnacies. Am. J. M. Genet. 90:233– 238.
5. Golden, W.L et al (1999). Mosaicsm in Prader Willi syndrome: detection using fluorescence in situ hybridization. Am. J. Med. Genet. 85:424-425.
6. Lim JH. et al (2002), "Amniotic fluid interphase fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of aneuploidy: experience in 130 prenatal cases", Journal of Korean Medicine Science, 17, pp. 589-592
7. Nicolaides KH. Nuchal translucency and other first-trimester sonographic markers of chromosomal abnormalities. Am J Obstet Gynecol 2004; 191:45-67.
8. Spencer K, Spencer CE, Power M, Dawson C, Nicolaides KH. Screening for chromosomal abnormalities in the first trimester using ultrasound and maternal serum biochemistry in a one stop clinic: A review of three years prospective experience. BJOH 2003b; 1001:281-6
9. Wandstrat, A.E et al (2000). Molecular and cytogenetics analysis of familial Xp deletions. Am. J. Med. Genet. 94:163-169
10. Weremowicz, S. et al (2001). Fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid detection of aneuploidy: experience in 911 prenatal cases. Prenat. Diagn. 21:262-269.